唐朝统一过程中，李世民功勋卓著，威胁到李建成的太子地位，引起李建成不安。李建成勾结齐王李元吉，数次加害李世民，李世民的幕僚都非常忧惧。房玄龄对长孙无忌道：“如今两方已经结怨，一旦祸患暗发，不只是秦王府难以收拾，便是国家存亡都成问题。不如劝说秦王行周公之举，安定家国。”长孙无忌道：“我早就有这想法了，只是一直不敢说，你的话正和我的心意。”于是，长孙无忌与房玄龄、杜如晦一同劝说李世民先发制人，诛杀李建成与李元吉。

武德九年（626年），李建成向李渊进谗，将房玄龄、杜如晦逐出秦王府，李世民的心腹幕僚只剩长孙无忌。长孙无忌坚决支持房玄龄的动议，与舅父高士廉和秦王府部将侯君集、尉迟敬德等人日夜劝说李世民，让他诛杀太子与齐王。李世民仍犹豫不决。这时，李建成以反击突厥侵犯为名，推荐李元吉督军北征，又抽调秦王府精兵猛将，并计划在饯行时伏杀李世民。李世民得知，遂决定发动兵变，命长孙无忌将房玄龄、杜如晦秘密召回，一同谋划。

同年六月，李世民率长孙无忌、尉迟敬德、侯君集、张公谨、刘师立、公孙武达、独孤彦云、杜君绰、郑仁泰、李孟尝等人埋伏在玄武门，成功诛杀太子李建成、齐王李元吉。不久，唐高祖册立李世民为皇太子，任命长孙无忌为太子左庶子。八月，李世民即位，是为唐太宗，册封妻子长孙氏为皇后，以长孙无忌为左武侯大将军。后来，罗艺在幽州反叛，长孙无忌担任行军总管，征讨罗艺。

武德九年六月初四庚申日（626年7月2日），李世民率领长孙无忌、尉迟恭、侯君集、张公谨、刘师立、公孙武达、独孤彦云、杜君绰、郑仁泰、李孟尝（一说为长孙无忌、尉迟恭、房玄龄、杜如晦、宇文士及、高士廉、侯君集、程知节、秦琼、段志玄、屈突通、张士贵）等人入朝，并在玄武门埋下伏兵。李建成、李元吉二人不知底细，也一起入朝，骑马奔向玄武门。此时，高祖已经将裴寂、萧瑀、陈叔达、封德彝、裴矩等人召集前来，准备查验这件事情了。

李建成、李元吉来到临湖殿，察觉到了变化，立即掉转马头，准备向东返回东宫和齐王府。李世民跟在后面呼唤他们，李元吉心虚，先张弓搭箭射向李世民，但由于心急，一连两三次都没有将弓拉满，箭没有射中。李世民却搭弓射向李建成，将他射死了。尉迟恭带领骑兵七十人相继赶到，他身边的将士用箭射中了李元吉，李元吉跌下马来。可就在此时，李世民的坐骑受到了惊吓，带着李世民奔入玄武门旁边的树林，李世民又被林中的树枝挂住，从马上摔下，倒在地上，一时爬不起来。李元吉迅速赶到，夺过弓来，准备勒死李世民，就在这时尉迟恭跃马奔来大声喝住了他。李元吉知道不是对手，赶紧放开李世民，想快步跑入武德殿寻求父皇庇护，但尉迟恭快马追上他，放箭将他射死了。

太子李建成的部下、翊卫车骑将军冯立得知建成身死，叹息道：“难道能够在太子生前蒙受恩惠而太子一死便逃避祸难吗！”于是，他与副护军薛万彻、屈直府左车骑谢叔方率领东宫和齐王府的精锐兵马两千人，急驰赶到玄武门，准备为太子和齐王报仇。张公谨臂力过人，他独自关闭了大门，挡住冯立等人，冯立等人无法进入。云麾将军敬君弘掌管着宿卫军，驻扎在玄武门。他挺身而起，准备出战，与他亲近的人阻止他说：“事情未见分晓，姑且慢慢观察事态的发展变化，等到兵力汇集起来，结成阵列再出战，也为时不晚。”敬君弘不听从，便与中郎将吕世衡大声呼喊着向敌阵冲去，结果全部战死。把守玄武门的士兵与薛万彻等人奋力交战，持续了很长时间，薛万彻擂鼓呐喊，准备进萧驰野秦王府，将士们大为恐惧。此时，尉迟恭提着建成和元吉的首级给薛万彻等人看，东宫和齐王府的人马顿失战心，迅速溃散，薛万彻与骑兵数十人则逃入终南山中。冯立杀死敬君弘后，对部下说：“这也可以略微报答太子殿下了。”于是，他丢掉兵器，落荒而逃。至此，以秦王李世民的胜利而告终。